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建議一齊購買： + NT$ 1237 《 现代分子生物学技术与实验技巧 》 + NT$ 315 《 分子医学实验技术（面向21世纪高等医药院校精品课程教材及配套用书） 》 + NT$ 531 《 医学免疫学实验技术（第2版/研究生） 》 + NT$ 621 《 医学分子生物学实验技术（第3版/研究生） 》 + NT$ 735 《 生物化学与分子生物学（第八版/本科临床/十二五规划） 》 編輯推薦： 近年来，生物化学与分子生物学实验技术发展很快，使得该领域不断有新的发现。实验课也普遍受到重视，不仅增加了学时，而且单独开课，单独计算学分。实验课已不再是理论课的附属品，而是培养学生创新思维的有效途径。为了帮助医学生更好地学习掌握生物化学与分子生物学实验技术，我们编写了这本实验教材。全书共计 16章，以实验技术为主线编写，主要介绍大分子制备技术、分光光度技术、层析技术、电泳技术、离心技术、分子杂交技术、 PCR技术、测序技术、转基因技术、基因敲除技术、蛋白质组学技术、 EMSA和 ChIP技术、酵母双杂交等技术，另外还介绍有关技术创新和实验室管理等内容。这些内容基本反映了生物化学与分子生物学实验技术的大体面貌。在介绍实验技术的同时，还编写了一些实验项目，以方便学生通过实验练习更好地理解掌握有关技术。 內容簡介： 本教材介绍了生物化学与分子生物学的常用实验技术，包括大分子制备技术、分光光度技术、层析技术、电泳技术、离心技术、分子杂交技术、 PCR技术、测序技术、转基因技术、基因敲除技术、蛋白质组学技术、 EMSA和 ChIP技术、酵母双杂交技术等，以及实验技术的发展简史、技术创新、实验室管理等内容。在介绍技术的同时还配有相应的实验，以供学生在系统了解有关技术的同时进行实验练习。本教材既可以自成体系、独立成课使用，也可以与理论教材配套使用；既可以作为实验教材，也可以作为考研的复习材料。 本教材的主要对象为医学院校各专业的本科生，也可供其他类型院校的学生参考使用。 目錄： 第 1章　如何在分子水平研究生命 ....... 1 第 1节分子实验技术简史 ...................... 1 第 2节分子实验技术体系 ...................... 4 一、生物分子的分析鉴定 ...................4 二、生物分子的人工合成 ...................5 三、生物分子的人工改造 ...................5 四、生物分子的功能研究 ...................6 第 3节分子实验技术应用 ...................... 7 一、电泳技术在临床检验中的应用 ...............................................7 二、 DNA重组技术在医药卫生领域的扩展 ...................................7 三、基因诊疗技术在未来医学的前景 ...............................................8 四、动物模型在医学研究中的重要地位 .........................................................9 第 2章　从组织中分离纯化生物大分 子大分子制备技术 .......... 10 第 1节材料预处理及细胞的分离 ........ 11 一、选择材料及预处理 .....................11 二、细胞的分离 .................................11 第 2节细胞破碎及细胞器分离 ............ 12 一、细胞的破碎 .................................12 二、细胞器的分离 .............................13 第 3节大分子的分离纯化与测定 ........ 13 一、蛋白质的分离纯化 .....................13 二、核酸的分离纯化 .........................14 三、蛋白质浓度的测定 .....................15 四、核酸的浓度、纯度及完整性 测定 .............................................17 第 4节生物大分子提纯后的处理 ........ 18 一、大分子样品的浓缩 .....................18 二、大分子样品的干燥 .....................18 三、大分子样品的保存 .....................19 第 5节实验练习 .................................... 20 一、蛋白质的盐析与透析 .................20 二、蛋白质含量测定 ........................21 第 3章　测定物质的吸收光谱分光 光度技术 .................................... 24 第 1节　分光光度技术的基本原理 ........ 24 一、光的性质 .....................................24 二、光谱 .............................................25 三、 Lambert-Beer定律 .....................26 第 2节　分光光度计的基本结构 ............ 27 一、光源 .............................................28 二、分光系统 .....................................28 三、样品室 .........................................29 四、检测器 .........................................29 五、显示器 .........................................30 第 3节　常用分光光度计的使用方法 .... 30 一、 721型分光光度计 ......................30 二、 721e型分光光度计 ....................31 三、 722s型分光光度计 ....................31 四、 SP-756紫外 -可见分光光度计 ...31 第 4节　分光光度技术的应用 ................ 31 一、溶液的定性分析 .........................32 二、溶液的定量分析 .........................32 第 5节　实验练习 .................................... 33 一、蛋白质的定量测定 .....................33 二、脲酶 Km值测定 ..........................37 三、血清丙氨酸氨基转移酶活性测定（赖氏法） ...........................40 四、血糖的定量测定（葡萄糖氧化酶法） ................................42 五、激素对血糖浓度变化的影响 .....43 六、血浆高密度脂蛋白 -胆固醇的测定 .........................................45 七、紫外分光光度法检测核酸的浓度及纯度 .............................46 第 4章　将混合物中各种组分分开 层析技术 .................................... 48 第 1节　层析技术概述 ............................ 48 一、层析技术的形成和发展 .............48 二、层析技术的基本原理 .................49 三、层析技术的分类 .........................49 四、层析技术的基本要求 .................50 第 2节　吸附层析 .................................... 50 一、吸附层析的原理 .........................50 二、吸附层析的操作 .........................50 第 3节　分配层析 .................................... 52 一、纸层析的原理 .............................52 二、纸层析的操作 .............................52 第 4节　凝胶过滤层析 ............................ 54 一、凝胶过滤层析的原理 .................54 二、凝胶过滤层析的特征常数 .........54 三、凝胶过滤层析的常用介质 .........55 四、凝胶过滤层析的操作 .................56 五、凝胶过滤层析的应用 .................57 第 5节　离子交换层析 ............................ 57 一、离子交换层析的原理 .................57 二、离子交换剂 .................................58 三、离子交换层析的操作 .................59 四、离子交换层析的应用 .................61 第 6节　亲和层析 .................................... 61 一、亲和层析的原理 .........................61 二、亲和层析的操作 .........................62 第 7节　实验练习 .................................... 63 一、氨基酸的分离鉴定纸层 析法 .............................................63 二、转氨酶的活性鉴定薄层层析法 .............................................64三、核苷酸的分离离子交换柱层析法 .........................................65四、胰蛋白酶的分离纯化亲和层析法 .........................................67五、血清蛋白质的层析分离分子筛层析法 .............................68 第 5章　分离带电颗粒的有效手段 电泳技术 .................................... 69 第 1节　电泳技术概述 ............................ 69 一、电泳技术的形成和发展 .............69 二、电泳技术的基本原理 .................70 第 2节　影响电泳的因素 ........................ 71 一、溶液的 pH...................................71 二、缓冲液的离子强度 .....................71 三、电场强度 .....................................72 四、电渗作用 .....................................72 第 3节　常用电泳技术 ............................ 72 一、纸电泳和醋酸纤维素薄膜 电泳 .............................................72 二、凝胶电泳 .....................................73 三、等电聚焦电泳 .............................75 四、双向电泳 .....................................76 五、核酸电泳 .....................................77 六、印迹转移电泳 .............................79 第 4节　实验练习 .................................... 79 一、血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 .............................................79二、血清乳酸脱氢酶同工酶琼脂糖凝胶电泳 .................................81三、血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳 ...........................................82四、 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量 .........83五、 DNA琼脂糖凝胶电泳 ...............86六、限制性内切酶对质粒 DNA酶切产物的电泳鉴定 .................87 VII 目录 第 6章　利用离心场沉降大分子 离心技术 .................................... 90 第 1节离心技术的基本原理 ................ 90 一、颗粒沉降的原理 .........................90 二、沉降系数 .....................................91 三、相对离心力 .................................91 第 2节　离心机的类型及操作规程 ........ 91 一、离心机的类型 .............................91 二、制备型离心机 .............................92 三、分析型离心机 .............................94 四、离心操作的注意事项 .................94 第 3节　制备型超速离心的分离方法 .... 95 一、差速沉降离心法 .........................95 二、密度梯度区带离心法 .................95 三、等密度梯度区带离心法 .............96 第 4节　实验练习 .................................... 96 一、肝糖原的提取和鉴定 .................96 二、酪蛋白的制备 .............................97 三、动物肝脏 DNA的提取 ..............98 四、酵母 RNA的提取及成分 鉴定 ...........................................100 五、质粒 DNA的提取与鉴定 ........101 六、感受态细菌的制备及质粒 DNA的转化 .............................104 七、蔗糖密度梯度离心分离 病毒 ...........................................106 第 7章　利用碱基互补探查核酸序列分子杂交技术 ............ 109第 1节　核酸分子杂交的基本原理 ...... 109一、变性与复性 ...............................109二、建立在 DNA变性与复性基础上的核酸杂交技术 ...................110第 2节　核酸分子杂交的主要类型及程序 ...........................................111一、固相杂交的支持物 ...................111二、常用的转移方法 .......................112三、固相杂交的基本程序 ...............112四、固相杂交的主要类型 ...............113 第 3节　核酸探针的分类和标记 .......... 114 一、核酸探针的分类 .......................114 二、核酸探针的标记 .......................115 第 4节　实验练习 .................................. 117 一、 Southern杂交 ...........................117 二、 Northern杂交 ...........................118 三、组织原位杂交 ...........................120 四、斑点杂交 ...................................121 第 8章　微量 DNA的体外扩增 PCR技术 ................................. 123 第 1节　 PCR技术概述 ......................... 123 一、基本原理 ...................................123 二、主要步骤 ...................................123 三、主要特点 ...................................124 第 2节　 PCR的反应体系及操作 ......... 125 一、 PCR反应体系 ..........................125 二、 PCR的操作及注意事项 ..........125 三、 PCR反应条件的优化 ..............127 四、 PCR产物的检测分析 ..............128 第 3节　 PCR的衍生技术 ..................... 128 一、逆转录 -PCR.............................128 二、实时荧光定量 PCR ..................129 三、特殊 PCR ..................................130 第 4节　 PCR技术的应用 ..................... 132 一、分子生物学领域 .......................132 二、临床医学领域 ...........................133 三、其他领域 ...................................134 第 5节　实验练习 .................................. 134 逆转录 PCR ......................................134 第 9章　阅读遗传天书的第一步测序技术 .................................. 137第 1节　 DNA测序的基本原理 ............ 137第 2节　 DNA测序的常用方法 ............ 138一、酶学法双脱氧链终止法 .......................................138二、化学（裂解）法 Maxam-Gilbert测序法 ..........................140 三、酶学法与化学法的比较 ...........141第 3节 DNA测序自动化 .................... 143第 4节实验练习 .................................. 144双脱氧链终止法测定 DNA序列 ....144 转基因技术 ........................... 147 第 1节转基因技术概述 ...................... 147 一、转基因动物技术的原理 ...........147 二、转基因动物技术的成果 ...........148 第 2节建立转基因动物的方法 .......... 149 一、目的基因的制备 .......................149 二、转基因动物的制备方法 ...........149 三、转基因小鼠 ...............................156 第 3节转基因动物的应用 .................. 156 一、研究基因的结构和功能及其表达与调控 ...............................156二、建立人类疾病动物模型 ...........157三、研究人类疾病基因治疗 ...........157四、利用转基因动物生产生物活性蛋白 ...................................157五、利用转基因动物生产人用器官移植的供体 .......................158六、利用转基因技术改良动物品种和生产性能 .......................158第 4节转基因的安全性问题 .............. 159一、转基因生物的安全性 ...............159二、转基因食品的安全性 ...............159第 5节实验练习 .................................. 160 一、转基因动物技术中外源基因的制备 .......................................160二、显微注射 ...................................161 第 11章　置换生物体的某种基因基因打靶技术 ....................... 165第 1节基因敲除技术概述 .................. 165一、基因敲除技术的建立和发展 ...........................................165二、基因敲除的基本原理 ...............167第 2节基因敲除的方法及进展 .......... 170 一、条件性基因敲除法 ...................170 二、诱导性基因敲除法 ...................171 三、利用随机插入突变进行基因 敲除 ...........................................171 第 3节基因敲除小鼠的制备过程 ...... 174 一、目标载体的构建 .......................174 二、 ES细胞培养 .............................174 三、 ES细胞的转化 .........................175 四、挑克隆 .......................................175 五、抗性 ES细胞克隆的冻存 ........175 六、 ES细胞基因组 DNA的 提取 ...........................................175 七、克隆的分析和鉴定 ...................175 八、染色体分析 ...............................176 九、嵌合体小鼠的制备 ...................176 十、品系的建立 ...............................176 第 4节基因敲除技术的应用及缺陷 ... 177 一、基因敲除技术的应用 ...............177 二、基因敲除技术的缺陷 ...............178 第 12章　21世纪的生命科学技术 蛋白质组学技术 ................... 180 第 1节　蛋白质组学概论 ...................... 180 一、蛋白质组学 ...............................180 二、蛋白质组学研究的策略和 范围 ...........................................182 三、蛋白质组学发展趋势 ...............182 第 2节　蛋白质组学技术 ...................... 183 一、样品制备 ...................................183 二、样品分离技术 ...........................184 三、样品鉴定技术 ...........................190 第 3节　蛋白质组生物信息学 .............. 195 第 4节　实验练习 .................................. 196 一、家兔血清蛋白质组二维凝胶 电泳技术的建立 .......................196 二、正常人尿蛋白质组学研究 .......198 第 13章　蛋白质与核酸相互作用分析 EMSA和 ChIP技术 .....200第 1节　电泳迁移阻滞实验（EMSA）... 200 目录 IX 一、电泳迁移阻滞实验（ EMSA）的基本原理 ...............................200二、电泳迁移阻滞实验（ EMSA）的基本操作步骤 .......................200第 2节　染色质免疫沉淀（ ChIP）技术 .......................................... 202一、染色质免疫沉淀（ ChIP）技术的基本原理 ...............................202二、染色质免疫沉淀（ ChIP）技术的基本操作步骤 .......................202第 3节　实验练习 .................................. 204一、经 EMSA验证姜黄素可减少 B淋巴细胞核中 NF-B的量 .....204二、经 ChIP验证姜黄素可减少 B淋巴细胞核中 NF-B的量 .....207 第 14章　蛋白质和蛋白质相互作用分析酵母双杂交等技术 ....211第 1节　概述 .......................................... 211一、蛋白质相互作用的分子结构基础 ...........................................211二、蛋白质相互作用分析的意义 ...212三、相互作用蛋白质组学的研究技术平台 ...................................213 第 2节　酵母双杂交技术 ...................... 215一、酵母双杂交系统的原理 ...........215二、酵母双杂交系统的应用 ...........216三、酵母细胞内的高通量酵母 双杂交 .......................................216四、酵母双杂交系统的几个版本 ...216五、酵母双杂交系统的假阳性 问题 ...........................................217 第 3节　其他常用技术 .......................... 217一、细菌双杂交技术 .......................217二、噬菌体展示技术 .......................218三、依赖亲和力筛选相互作用 蛋白质的技术 ...........................219 四、蛋白质芯片技术 .......................221 第 4节　实验练习 .................................. 222 一、酵母双杂交技术筛选 TRAC-1相互作用蛋白 ...........................222二、 GST融合蛋白沉降技术筛选 RNF114相互作用蛋白 ............226 第 15章　科学发展的不竭源泉技术创新 .................................... 230 第 1节　三性实验 ............................ 230一、三性实验的概念 .................230二、三性实验的特点和意义 .....230三、实验教学体系的改革 ...............231四、三性实验的基本要求 .........232五、三性实验的一般程序 .........232六、三性实验的选题原则 .........232七、三性实验的实施及评估 .....233 第 2节　实验练习 .................................. 233 一、酵母蔗糖酶的纯化及性质研究 ...........................................233二、猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定 ...........................................238三、 DNA重组实验 .........................241 实验室管理 ...................................249 第 1节实验室规则 .............................. 249 第 2节实验用品的清洗 ...................... 250 一、玻璃仪器的清洗 .......................250 二、塑料器皿的清洗 .......................251 三、实验器皿的干燥与消毒 ...........251 四、常用洗涤液及其配制 ...............251 第 3节实验标本的制备 ...................... 252 一、血液样品的制备与保存 ...........252 二、尿液标本的收集与保存 ...........253 三、组织样品的制备与保存 ...........253 第 4节实验仪器的使用 ...................... 254 一、刻度吸管的使用 .......................254 二、微量进样器的使用 ...................255 三、单道可调式移液器的使用 .......256 四、蒸汽压力灭菌器的使用 ...........256 五、酸度计的使用 ...........................256 六、干燥箱和恒温箱的使用 ...........258 七、电热恒温水浴锅的使用 ...........259 第 5节实验数据的处理 ...................... 259 一、列表法 .......................................259 二、作图法 .......................................260 三、少量实验数据的处理 ...............261 四、实验误差和提高实验准确度 的方法 .......................................261 第 6节实验报告的书写 ...................... 263 一、实验记录 ...................................263 一、一般化学试剂的分级及配制的注意事项 ...............................264二、实验室中常用酸碱的密度和浓度 ...........................................266三、常用缓冲溶液及配制方法 .......266四、溴化乙锭溶液的净化处理 .......271五、离心机转数与相对离心力的换算 ...........................................272六、硫酸铵饱和度的常用表 ...........273七、元素相对原子质量表 ...............275 二、实验报告 ...................................263参考文献 ...................................................277 第 7节常用实验数据 .......................... 264 內容試閱： 按照人体认知的逐级探索模式，从人体系统器官，到组织细胞 分子，分子处于最基础的层次，因此也是最触及生命本质的层次。随着学科 间的交叉融合，生物化学与分子生物学的理论和技术已经成为生命科学和医 学的通用理论和技术。作为一名现代医学生，学习掌握生物化学与分子生物 学的理论和技术，对于研究疾病的发病机制，提出疾病的诊疗方案至关重要 。 近年来，生物化学与分子生物学实验技术发展很快，使得该领域不断有新的 发现。实验课也普遍受到重视，不仅增加了学时，而且单独开课，单独计算 学分。实验课已不再是理论课的附属品，而是培养学生创新思维的有效途径 。为了帮助医学生更好地学习掌握生物化学与分子生物学实验技术，我们编 写了这本实验教材。全书共计 16章，以实验技术为主线编写，主要介绍大分 子制备技术、分光光度技术、层析技术、电泳技术、离心技术、分子杂交技 术、 PCR技术、测序技术、转基因技术、基因敲除技术、蛋白质组学技术、 EMSA和 ChIP技术、酵母双杂交等技术，另外还介绍有关技术创新和实验室管 理等内容。这些内容基本反映了生物化学与分子生物学实验技术的大体面貌 。在介绍实验技术的同时，还编写了一些实验项目，以方便学生通过实验练 习更好地理解掌握有关技术。 来自 14所院校的老师参加了本书的编写，他们长期奋战在教学一线，不仅从 事常规的实验教学，而且还要指导学生开展创新性、设计性、综合性实 验，指导学生毕业论文，因此都有自己的经验和体会，在书中也或多或少有 所反映。尽管如此，错漏之处仍不可避免，欢迎读者批评指正。 王玉明 2016年 10月于成都　 生物化学与分子生物学是在分子水平上研究生命的科学，是人类探索生命的知识结晶和有力武器。生物化学与分子生物学的完整体系不仅包括其理论体系，还包括其技术体系。该学科的快速发展在很大程度上得益于一系列实验技术的创新和仪器设备的发明，如 DNA重组技术、核酸分子杂交技术、 PCR技术、转基因技术、基因打靶技术、 DNA芯片技术、基因测序技术、蛋白质组学技术等，这些技术本身构成了生物化学与分子生物学的重要内容。生物化学与分子生物学实验技术以生物分子为研究对象，通过各种手段对其理化性质、组成结构、功能活性以及在生命活动中的作用进行研究，因此也称分子实验技术（ experimental techniques of the molecular）。 分子实验技术简史 早在 19世纪 30年代，李比希（ J. von Liebig）就将定量分析技术用于生物体的研究。 20世纪 20年代，微量分析技术用于生物分子的研究，促进了维生素、激素和辅酶的发现。 30年代，福林（ J. A. Folin）和吴宪先后建立了血糖分析、蛋白质含量分析、氨基酸测定等方法，这些方法至今仍在使用。1923年，斯维贝格（ T.Svedberg）制成了世界上第一台相对离心力（ relative centrifugal force， RCF）5000g的新型离心机，他用这台离心机准确测定了血红蛋白等复杂蛋白质的分子量，开启了用离心机分离生物大分子的先河，为此，他获得了 1926年的诺贝尔化学奖。为了纪念这位超离心技术的奠基人，人们将大分子沉降系数（ sedimentation coef.cient，S）的基数（ 10.13 s）命名为 1个 Svedberg单位（ 1S＝110.13 s）。1809年，列依斯（ Peйce）首次发现电泳现象。 1909年，米凯利斯（ L. Michaelis）首次将胶体颗粒在电场中的移动现象称为电泳（ electrophoresis）。1937年，提塞留斯（ A. W. K. Tiselius）对电泳仪器做了改进，制成提塞留斯电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明血清蛋白包括白蛋白及 、、球蛋白。由于在电泳技术方面做出的开拓性贡献，提塞留斯获得了 1948年的诺贝尔化学奖。 1948年，维兰德（ H. Wieland）和费舍尔（ H. Fischer）发展了以 滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸进行分离。 1949年，鲍林（ L. C. Pauling）等用电泳法证明镰形红细胞贫血是因为有异常血红蛋白的存在，据此引入分子病（ molecular disease）的概念。1950年，杜若姆（ E. L. Durrum）用纸电泳（ paper electrophoresis）进行各种蛋白质的分离，开创了利用各种固体物质（如滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。 1959年，雷蒙德（ S. Raymond）和温特劳布（ L. Weintraub）利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，极大提高了电泳的分辨率，开创了电泳技术的新时代。至今聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍、分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质纯度的标准分析鉴定方法，被看作是对生物大分子进行分析鉴定最准确也是最后的手段（ last check）。1969年，韦伯（ K. Weber）应用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定了蛋白质的分子量。 1981年，乔根森（ J. W. Jorgenson）和卢卡奇（ K. D. Lukacs）首先在 75 m内径毛细管柱内用高电压进行电泳，建立了高效毛细管电泳（ high performance capillaryelectrophoresis，HPCE）技术。 1984年，寺部清毅（ S. Terabe）等建立了胶束毛细管电动力学色谱方法。 1987年，赫尔特（ S. Hjerten）建立了毛细管等电聚焦电泳（ capillary isoelectric focusing，CIEF），寇恩（ A. Cohen）和卡尔格（ B. Karger）建立了毛细管凝胶电泳。 1988年出现了第一批毛细管电泳仪器。由于 HPCE高效、快速、经济，适用于多肽、蛋白质（包括酶和抗体）、核苷酸以及 DNA的分离分析，短短几年内得到了迅速发展。 HPCE是经典电泳技术和现代微柱分离技术相结合的产物，是一种可以自动化操作的高效分离技术。1961年，霍尔（ B. D. Hall）和施皮格尔曼（ S. Spiegelman）建立 DNA-RNA分子杂交法。分子杂交技术与电泳技术相结合，形成了新的实验技术印迹（ blotting）技术。 1975年，萨瑟恩（ E. M. Southern）利用凝胶电泳分离 DNA片段，然后将 DNA片段转移到硝酸纤维素膜上，利用 DNA-RNA杂交检测特定的 DNA片段，创立 Southern印迹法。尔后人们用类似的方法，对 RNA和蛋白质进行印迹分析，对 RNA的印迹分析称为 Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质进行印迹分析称为 Western印迹法，对双向电泳后的蛋白质进行印迹分析称为 Eastern印迹法。1935年，赫维西（ G. Hevesy）制得人工放射性磷，奠定了放射性同位素示踪技术的基础，这使他获得 1943年的诺贝尔化学奖。同年，舍恩海默（ R. Schoenheimer）和瑞顿伯格（ D.Rittenberg）将同位素示踪用于糖类及脂类物质的中间代谢的研究。 1942年，舍恩海默出版《身体成分的动态》，该书大量采用 2H、15N、18O、14C等重同位素示踪的方法追踪代谢途径，从而得出体内物质不断变化更新的动态概念。放射性同位素示踪技术在 20世纪 50年代有了很大发展，为阐明各种生物分子的代谢过程起了关键作用。1940年，马丁（ A. J. P. Martin）和辛格（ R. L. M. Synge）建立色层析法，后来又发展为纸层析及分配层析，并应用于分析氨基酸，他们因此获得 1952年的诺贝尔化学奖。 1949年，斯坦（W.H.Stein）和穆尔（ S.Moore）报告了用淀粉柱区带层析测定 -乳球蛋白的全部氨基酸组成。 40年代，层析技术有了很大发展，成为分离生物分子的关键技术； 60年代，层析技术又有了重大进展。 19681972年，安芬森（ C. B.An.nsen）建立了亲和层析（ af.nity chromatography，AC）技术，开辟了层析技术的新领域。19491950年，桑格（ F. Sanger）发展了 2, 4-二硝基氟苯法，埃德曼（ P. Edman）发展了异硫氰酸苯酯法鉴定肽链的 N-末端。 1953年，桑格研究出蛋白质序列的测定方法。 1958年，斯坦、穆尔和斯帕克曼（ D. H. Spackman）设计出氨基酸自动分析仪，加快了蛋白质的分析工作。 1967年，埃德曼和贝格（ G. Begg）建成多肽氨基酸序列分析仪。 1973年，穆尔和斯坦又设计出氨基酸序列自动测定仪，大大加快了多肽一级结构的测定。1975年，桑格建立 DNA碱基序列的分析方法并不断加以改进， 1977年完成了 -174噬菌体全部 5400个碱基序列的分析。 1976年，马克萨姆（ A. M. Mexam）和吉尔伯特（ W. Gilbert）建立了快速测定大片段 DNA序列的化学法。 1977年，桑格提出应用链终止抑制法测定 DNA序列。随后， DNA序列测定仪、 DNA合成仪等相继问世。 1985年，史密斯（ M. Smith）等报道了 DNA测序中应用荧光标记取代同位素标记的方法。桑格在大分子测序方面做出了杰出贡献，他曾经两次荣获诺贝尔化学奖， 1958年因为确定了胰岛素的分子结构获奖， 1980年又因为设计出测定 DNA核苷酸排列顺序的方法而与吉尔伯特和伯格（ P. Berg）共同获奖。 研究大分子的空间结构离不开电子显微镜技术和 X射线衍射技术。 1932年，克诺尔（ M. Knoll）和鲁斯卡（ E. Ruska）制成世界上第一台电子显微镜模型，后来鲁斯卡对模型做了改进，这就是现代电子显微镜的原型，电子显微镜打开了人类观察微观世界的窗口。 1938年，阿斯伯里（W. T. Asbury）等对核酸进行了 X射线研究；伯纳尔（ J. D. Bernal）等对糜蛋白酶进行了 X射线研究。以后，肯德鲁（ J. C. Kendrew）利用 X射线衍射技术测定了肌红蛋白的结构，佩鲁兹（ M. F. Perutz）分析了血红蛋白的结构，他们二人因此获得 1962年的诺贝尔化学奖。同年，威尔金斯（ M. H. F. Wilkins）用 X射线衍射技术证实了 DNA的双螺旋模型，与沃森（ J. D. Watson）和 克里克（ F. H. C. Crick）分享了当年的诺贝尔生理学或医学奖。 1965年，菲利普（ D. Phillips）首次用 X射线衍射技术阐明了鸡蛋清溶菌酶的三维结构。 1969年，霍奇金（ D. M. C. Hodgkin）获得 0.28 nm分辨率的胰岛素晶体结构的分析结果。 1970年和 1974年，梁栋材等先后完成了0.25 nm和 0.18 nm分辨率的牛胰岛素分子结构的分析工作。 1980年，安德森（ C. Anderson）和麦凯（ D.B.Mckay）利用 X射线分析法测定了两种 DNA结合蛋白质的结构。 1989年，约翰逊（ J. E. Johnson）等用 0.30 nm X射线分析法测定了一种二十面体病毒中蛋白质 -RNA的相互作用。1943年，钱斯（ B. Chance）首次将灵敏的分光光度法用于酶 -底物反应相互关系的研究。 20世纪 60年代，各种仪器分析方法用于生物化学研究取得很大的发展，如高效液相色谱（ high performance liquid chromatography，HPLC）技术，红外光谱（ infrared radiation，IR）、紫外光谱（ultraviolet spectrum，UV）、圆二色等光谱技术，磁共振（ nuclear magnetic resonance，NMR）技术等。20世纪 70年代，阿伯尔（ W.Arber）、史密斯（ H. O. Smith）和内森斯（ D. Nathans）发现并纯化了限制性核酸内切酶，这为后来的重组 DNA技术奠定了基础，他们 3人因此获得 1978年的诺贝尔生理学或医学奖。 1972年，伯格把猴细胞病毒 SV40的 DNA与 噬菌体的 DNA在体外重组成功。 1973年，寇恩（ S.N.Cohen）将外源 DNA片段插入大肠杆菌质粒后产生嵌合质粒，当嵌合质粒重新导入大肠杆菌时仍具有功能，这成为外源基因导入细菌的主要方法，从此开创了基因工程（ genetic engineering）。80～90年代，基因工程技术进入辉煌发展的时期。1984年，柯勒（ G. J. F. Kohler）、米尔斯坦（ C. Milstein）和杰尼（ N. K. Jerne）由于发展了单克隆抗体技术，完善了极微量蛋白质的检测技术而获得诺贝尔生理学或医学奖。 1985年，穆利斯（ K. Mullis）等建立了聚合酶链反应（ polymerase chain reaction，PCR）技术，使一向昂贵、繁杂的分子生物学实验能够在比较简易、经济的条件下有效地开展，这是基因分析技术的重大突破，对于生物化学与分子生物学的研究具有划时代的意义。这一技术在很短的时间里风行全球，在众多学科领域被广泛采用。穆利斯因此获得 1993年的诺贝尔化学奖。 分子实验技术体系 分子实验技术是在具体研究工作中建立起来并不断得到完善。从早期个别零散的实验方法，经过不断发展，形成了完整的实验技术体系。分子实验技术按其研究目的和特点可分为四个层次：第一层次是对生物分子进行分析鉴定；第二层次是对生物分子进行人工合成；第三层次是对生物分子进行人工改造；第四层次是对生物分子进行功能研究。一、生物分子的分析鉴定不同的生物分子具有不同的理化性质，据此可以对其进行分离制备和分析鉴定，具体方法又可分 5类：①根据生物分子大小不同，可采用凝胶过滤法、超滤法、超速离心法、 SDS电泳法等。②根据生物分子荷电不同，可采用等电聚焦电泳法、离子交换层析法等。③根据生物分子吸收光谱和放射性不同，可采用分光光度法（包括紫外光、红外光、荧光）、X射线结构分析法、共振法（包括电子顺磁共振、电子自旋共振、磁共振）、放射性同位素示踪法、放射免疫分析法等。④根据生物分子疏水相互作用或氢键形成的引力不同，可采用反相高效液相层析法、分子杂交法等。⑤根据生物分子特异相互作用不同，可采用亲和层析法、免疫化学分析法等。二、生物分子的人工合成不同的生物分子具有不同的组成和结构，在搞清楚生物分子结构的前提下，可以对其进行人工合成。 1828年，乌勒（ F. Wohler）用氨及氰酸铅合成了第一个有机化合物尿素； 1953年，杜维尼奥（ V. du Vigneaud）合成了第一个多肽催产素（ oxytocin）；1965年，中国人合成了第一个蛋白质牛胰岛素； 1981年，中国人合成了第一个核酸酵母丙氨酸 tRNA。这标志着人们不仅可以合成生物小分子，也可以合成生物大分子，尤其是合成生物大分子是极富挑战性的工作。例如，合成牛胰岛素就花了 7年时间。 1963年，梅里菲尔德（ B.Merri.eld）提出固相合成法，并于 1969年人工合成了具有酶活性的牛胰核糖核酸酶。这一方法后来成为合成中等大小多肽的常用方法，在此基础上设计出多肽合成的自动装置，梅里菲尔德因此获得 1984年的诺贝尔化学奖。现在氨基酸序列分析和序列合成、核苷酸序列分析和序列合成已经实现自动化。三、生物分子的人工改造生物分子的结构与功能有着密切的关系，尤其是生物大分子的组成和结构非常复杂，是长期自然进化的产物，对其进行改造，有可能使之产生新的功能。基因工程的兴起使人们可以按照预先的设计对 DNA进行剪切拼接，将其引入细胞中进行克隆表达。基因工程是重组 DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大部分。上游技术即重组 DNA技术，主要是基因重组、克隆和表达的设计与构建；下游技术主要是基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化。从 20世纪 70年代开始，基因工程的发展已经有四代：第一代是经典基因工程，主要是使蛋白质或多肽基因进行高效表达。第二代是蛋白质工程（ protein engineering），主要是通过基因的定向诱变使之表达出具有特殊功能的蛋白质。第三代是代谢工程（ metabolic engineering），主要是利用基因工程技术定向改造细胞的代谢途径，以改善产物的形成和细胞的性能。第四代是基因组工程（ genome engineering），主要是进行基因组或染色体的转移，也称染色体工程（chromosome engineering）。

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