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　创新实验6表面等离子共振技术测定叶酸与叶酸受体蛋白结合常数 一、知识背景 二、实验目的 三、实验原理 四、仪器与材料 五、实验方法与步骤 六、数据处理 七、结果与讨论 八、注意事项 九、思考题 十、实验延伸 十一、参考文献 　创新实验7生物细胞膜的分离及其重要成分的分析 一、知识背景 二、实验目的 三、实验原理 四、仪器与材料 五、实验方法与步骤 六、数据处理 七、结果与讨论 八、注意事项 九、实验延伸 十、思考题 十一、参考文献 第二部分化学生物学基础操作实验 　基础操作实验1加样器的正确使用和校正 一、实验目的 二、实验原理 三、仪器与试剂 四、实验方法与步骤 　基础操作实验2无菌操作消毒灭菌与培养 一、实验目的 二、实验原理 三、仪器与材料 四、实验方法与步骤 五、结果与讨论 六、注意事项 七、思考题 　基础操作实验3琼脂糖凝胶电泳检测DNA 一、实验目的 二、实验原理 三、仪器与试剂 四、实验方法与步骤 五、结果与讨论 六、注意事项 七、思考题 　基础操作实验4大肠杆菌感受态细胞制备与质粒DNA的转化 一、实验目的 二、实验原理 三、仪器与材料 四、实验方法与步骤 五、结果与讨论 六、注意事项 七、思考题 　基础操作实验5核酸的分离及其定量分析 一、实验目的 二、实验原理 三、仪器与材料 四、实验方法与步骤 五、结果与讨论 六、注意事项 七、思考题 　基础操作实验6Bradford法测定蛋白质含量 一、实验目的 二、实验原理 三、仪器与材料 四、实验方法与步骤 五、结果与讨论 六、注意事项 七、思考题 　基础操作实验7高效液相色谱柱的装填与测试 一、实验目的 二、实验原理 三、仪器与材料 四、实验方法与步骤 五、结果与讨论 六、注意事项 七、思考题 　基础操作实验8高效反相液相色谱过程热力学函数的测定 一、实验目的 二、实验原理 三、仪器与材料 四、实验方法与步骤 五、结果与讨论 六、注意事项 七、思考题 　基础操作实验9体积排阻色谱法分离标准蛋白 一、实验目的 二、实验原理 三、仪器与材料 四、实验方法与步骤 五、结果与讨论 六、注意事项 七、思考题 　基础操作实验10MTT法检测秋水仙碱的细胞毒性 一、实验目的 二、实验原理 三、仪器与材料 四、实验方法与步骤 五、结果与讨论 六、注意事项 七、思考题 第三部分化学生物学综合实验 　综合实验1质粒DNA微量制备与鉴定 一、实验目的 二、实验原理 三、仪器与材料 四、实验方法与步骤 五、结果与讨论 六、注意事项 七、思考题 　综合实验2外源基因体外扩增、质粒构建及其分析 一、实验目的 二、实验原理 三、仪器与材料 四、实验方法与步骤 五、结果与讨论 六、注意事项 七、思考题 　综合实验3SDS PAGE及其蛋白质相对分子质量测定 一、实验目的 二、实验原理 三、仪器与材料 四、实验方法与步骤 五、结果与讨论 六、注意事项 七、思考题 　综合实验4蛋白质的变性、凝固及其沉淀反应 一、实验目的 二、实验原理 三、仪器与材料 四、实验方法与步骤 五、结果与讨论 六、注意事项 七、思考题 　综合实验5钙调蛋白的分离纯化 一、实验目的 二、实验原理 三、仪器与材料 四、实验方法与步骤 五、结果与讨论 六、注意事项 七、思考题 　综合实验6一种天然无序蛋白质的表达、纯化及其构象变化 一、实验目的 二、实验原理 三、仪器与材料 四、实验方法与步骤 五、结果与讨论 六、注意事项 七、思考题 　综合实验7弱阳离子交换蛋白折叠液相色谱法复性还原变性溶菌酶 一、实验目的 二、实验原理 三、仪器与材料 四、实验方法与步骤 五、结果与讨论 六、注意事项 七、思考题 　综合实验8基于神经氨酸酶受体的分子对接 一、实验目的 二、实验原理 三、实验软件程序 四、实验方法与步骤 五、结果与讨论 六、思考题 　综合实验9纳豆激酶及蚓激酶催化纤维蛋白降解反应的动力学 一、实验目的 二、实验原理 三、仪器与材料 四、实验方法与步骤 五、结果与讨论 六、注意事项 七、思考题 　综合实验10功能切换型的防生物污染的表界面构建 一、实验目的 二、实验原理 三、仪器与材料 四、实验方法与步骤 五、结果与讨论 六、注意事项 七、思考题 　综合实验11药物作用后肿瘤细胞膜超微结构的原子力显微镜法 一、实验目的 二、实验原理 三、仪器与材料 四、实验方法与步骤 五、结果与讨论 六、注意事项 七、思考题 　综合实验12荧光素类焦磷酸根离子荧光探针的制备及荧光性质 一、实验目的 二、实验原理 三、仪器与材料 四、实验方法与步骤 五、结果与讨论 六、注意事项 七、思考题 　综合实验13　2，7 二氯荧光素的合成 一、实验目的 二、实验原理 三、仪器与材料 四、实验方法与步骤 五、结果与讨论 六、注意事项 七、思考题 综合实验14新型香豆素类荧光探针的合成与性能 一、实验目的 二、实验原理 三、仪器与材料 四、实验方法与步骤 五、结果与讨论 六、思考题 　附录 　附录一化学生物学实验须知 　附录二实验记录及实验报告的书写 　附录三常用器皿的洗涤与处理 　附录四缩写、符号、换算系数和数据 　附录五重要分子的物理常数及性质 內容試閱： 第一部分创新实验 创新实验1人工金属核酸酶——邻菲罗啉铜配合物的合成及其与DNA作用 Experiment 1 Artificial metallonuclease—copper complex with 1，10 phenanthloline: synthesis and initial DNA interaction 关键词 人工金属核酸酶artificial metallonuclease，DNA相互作用DNA interaction 一、 知识背景 1.人工金属核酸酶过渡金属离子配合物在识别核酸结构和核酸断裂方面具有独特的性质，因此被广泛地应用于核酸酶的研究中，称为人工金属核酸酶。 自1993年Sigman发现第一个金属核酸酶——邻菲罗啉铜配合物与天然核酸酶具有相同或类似的生物活性以来，人们合成出了大量的金属核酸酶并对其性能进行了深入的研究。人工金属核酸酶与限制性内切核酸酶相比，既具有高度专一性，又能在人们预先设计的任何位点断裂DNA，而且克服了传统的限制性内切核酸酶识别位点仅为4～8个核苷酸的限制，可用于肿瘤基因治疗与新的化学疗法等临床医学领域。由于金属核酸酶能插入和识别核酸的一些特定结构，可以在光照等条件下使其特定部位断裂或通过电子传递使DNA的损伤得以修复，因此极有希望从人工金属核酸酶中遴选出一些与基因有关的疾病的“诊断试剂”和化学治疗药物。 金属核酸酶的识别作用已有很多成功的例子。1997年，Barton的研究小组利用铑配合物对大沟的嵌入使得偶联锌的小肽金属配合物实现了短链DNA的水解切割，并可能用于模拟限制性内切核酸酶的性质。也有研究发现，配合物［Cotfa2happ］2+tfa=trifluoroacetate，happ=［1，3，5，8，10，12］hexaazacylotetradecane可以作为DNA外凸bulge位点的结构探针。经过H2O2的激活，该金属配合物可以断裂DNA，DNA的断裂点正好在DNA的外凸处，从而使之成为DNA外凸位点的结构探针。Burrows等发现平面结构的大环NiⅡ配合物与DNA中鸟嘌呤的N7原子发生配位作用，而对其他碱基则呈现反应惰性。大环NiⅡ配合物成为该类DNA的其他区域中碱基错配、外凸、成环及末端鸟嘌呤可靠的鉴定试剂。由此也开辟了大环NiⅡ配合物作为DNA分子中鸟嘌呤结构探针新的研究领域。国内的计亮年研究组对多吡啶钌配合物的核酸序列识别及拓扑异构酶抑制进行研究，得到了高效的拓扑异构酶抑制剂。郭子建研究组对用多核铜的配合物对DNA进行切割的协同效应进行了研究，但切割的原因和机理尚不清楚。此外，杨频研究组用分子力学方法模拟了Δ，Λ ［Ruphen2dppz］2+（dppz=dipyrido［3，2 a∶2′，3′ c］ phenazine）对含G∶T错配的环丁烷嘧啶二聚体（cyclobutane pyrimidine dimer，CPD）双螺旋DNA的识别作用。模拟结果显示，这种金属配合物的Λ异构体优先从小沟方向识别与G∶T错配相邻的区域，而Δ异构体则优先从大沟方向识别与G∶T错配相邻的另一区域。以上涉及的金属核酸酶结构式如图1-1所示。 图1-1一些金属核酸酶的结构式 图1-1续 2.金属核酸酶与核酸作用的研究方法 用于研究金属核酸酶与DNA作用的研究方法主要有：电子吸收光谱、电子发射光谱、线二色谱linear dichroism，LD和圆二色谱circular dichroism，CD、X射线衍射、核磁共振NMR谱、电化学方法，也有一些利用流体力学和密度泛函理论density functional theory，DFT计算等方法。 1 电子吸收光谱 电子吸收光谱是研究金属配合物与DNA相互作用的一种应用广泛、操作简单、有效的方法。金属配合物与DNA结合后导致配体所处的化学环境发生改变，体现为吸收光谱的波长和强度发生变化，这种变化反映了二者相互作用的强弱。一般来说，配合物与DNA插入结合时，其吸收光谱通常有减色效应，并伴有一定程度的红移现象。减色效应的程度与配合物和DNA作用的强弱成正比，减色效应越大，说明配合物与DNA的作用越强。但也有例外，DNA的加入会使某些配合物的吸收光谱出现增色效应。另外，一些不插入DNA的染料如甲基绿、甲基蓝加入DNA时也会引起吸收峰的红移和吸收光谱的减色。因此，仅凭吸收光谱判断金属配合物与DNA的作用模式，有时会得出不正确的结论。 2 电子发射光谱 金属配合物以插入方式与DNA结合后，由于金属配合物分子的振动模式受到限制，同时减少了金属配合物受水分子或其他阴离子猝灭剂猝灭的机会，其发射光谱一般会增强，但不表示金属配合物发射光强度越强，其结合DNA的能力越强。Tuite等发现，与DNA紧密结合的发光物会把激发态电子传给DNA核苷而导致发光猝灭，减弱发光强度。 3 线二色谱和圆二色谱 线二色谱采用与固定光轴方向平行或垂直的平面偏振光，测量结合DNA后的配合物对垂直和平行于DNA的线偏振光的不同吸收二色性，计算配合物与DNA的相对取向。利用线二色谱技术和有关计算可以得到金属配合物与DNA相互作用、键合几何学方面的信息。 圆二色谱可以检测物质的旋光性，该方法通常与平衡透析实验结合可以用来研究外消旋配合物与DNA相互作用的立体选择性。如果消旋化的配合物对DNA透析达到平衡后出现圆二色性信号，则证明配合物对DNA产生了立体选择性的结合。 4 X射线衍射 单晶X射线衍射技术是提供配合物与DNA作用的结构信息的精确的实验手段。只要能培养出金属配合物和核酸在结合状态下合适的单晶，就能利用单晶X射线衍射技术测量得到二者在作用位点等方面的详细和准确的信息。需要注意的是，由单晶X射线衍射技术得到的金属配合物与DNA在结晶状态的结构可能与二者在溶液中的行为不完全相同，尽管如此，由晶体结构测定得到的有关信息对于人们对二者相互作用机理的认识仍是十分有益的。 5 核磁共振谱 核磁共振谱也能提供配合物与DNA复合物相互作用的详细信息，尤其是二维核磁共振的出现。二维NOESY谱可给出配合物与DNA作用的具体位点的信息，包括二者作用的位点是在DNA的大沟还是小沟，以及碱基位置的特异性结合等信息。这一技术所提供的信息是上述光谱等手段所无法获得的，也是近几年来在更深层次上探测小分子化合物与DNA键合的机理所采用一种新技术。 6 电化学方法 电化学方法是研究电子转移方面的有力手段，它可以对光谱实验结果进行有效的补充，从而更深入地了解金属配合物与DNA相互作用的机理。此方法使用最多的是循环伏安法CV。Mahadevan等研究了金属配合物［Cudpsmp2］2+［dpsmp=2，9 dimethyl 4，7 bissulfonaphenyl 1，10 phenanthroline］与DNA结合的电化学行为，未加入DNA时，其还原反应主要由扩散过程控制，加入DNA后，配合物的半波电位、阴极和阳极的电势差以及阴极与阳极峰电流比值等参数都发生了较大幅度的减小。Barton小组采用循环伏安法以道诺霉素作为电子受体，以固定双链DNA的金电极作为电子给体，研究了DNA的电子传递特性。Thorp等采用循环伏安法研究了钌金属配合物对DNA的氧化断裂。 本实验采用紫外 可见光谱仪、荧光光谱仪和电化学工作站测定金属配合物与DNA作用前后的光学性能以及电化学特性的变化，初步推测人工金属核酸酶邻菲罗啉铜配合物与DNA的作用特征。 二、 实验目的 通过查阅相关文献，了解人工金属核酸酶的研究进展、应用价值和研究意义；了解人工金属核酸酶与核酸酶的专一性作用；了解分子识别及其在分子水平上金属配合物与生物分子DNA相互作用的研究。 通过溶液中的直接配位作用进行人工金属核酸酶邻菲罗啉铜配合物的制备，熟练掌握金属配合物反应的原理与操作方法；熟悉抽滤装置、旋转蒸发仪、熔点仪的操作。 通过对制备的人工金属核酸酶邻菲罗啉铜配合物进行分析，熟练掌握紫外分光光度仪测定DNA纯度的原理与操作；熟练掌握金属配合物的表征，包括人工金属核酸酶邻菲罗啉铜配合物与DNA分子相互作用的光谱性能和电化学性能；熟练掌握金属配合物Cuphen2Cl2与DNA的结合常数及结合位点的计算。 三、 实验原理 1.金属配合物反应的原理与方法 金属配合物的反应原理是配体和中心金属形成配位键的过程。金属配合物的合成方法主要有直接配位合成法、取代反应合成法、固相反应合成法、氧化还原反应合成法和大环模板反应合成法等。常采用小型的高压反应釜合成（图1-2）。 图1-2实验室常用的高压反应釜 1 直接配位合成法 直接配位合成法是最简单的合成配合物的方法。该合成方法是将金属原子（M）和配体（L）直接相互作用，根据Lewis酸碱理论，配合物的直接配位合成反应为M+∶L=M∶L。该方法包括溶剂法和水热溶剂热法。 1 溶剂法是将金属原子和配体分别溶解在合适的溶剂中，然后在常压下直接反应获得配合物的方法。溶剂法合成配合物时，提供中心原子的化合物一般是无机盐（如含氧酸盐、卤化物等）、氧化物或氢氧化物。对溶剂的要求是反应物在其中能较好地溶解，但碱性要小于目标化合物中配体的碱性，这样才能保证产物在其中不发生分解水解、醇解等，同时还要有利于产物分离。 2 水热溶剂热法是将金属盐和配体放入高压反应釜中，利用水或溶剂在高温高压下直接进行配合物生成的反应。水热溶剂热法适用于合成难溶或不溶的配合物。 2 取代反应合成法 取代反应合成法也称组分交换反应合成法，即通过对配合物中的某一组分进行交换、替代生成新的配合物的合成方法。一般可分为下列三种方法：金属交换法、配体取代法、配体上的取代反应。 1 金属交换法指金属配合物与其他金属的盐或化合物之间发生金属离子交换，可以用下式表示： 式中， M可以为过渡金属也可以为非过渡金属；M′为过渡金属；L为螯合配体。反应结果是生成了更加稳定的螯合物M′Lk。 2 配体取代法指在一定条件下，新配体可以置换原配合物中的一个、几个或全部配体，并得到新的配合物。该合成方法溶剂的选择及反应条件的控制是提高合成反应产率、减少副产物的关键。 3 配体上的取代反应是指当席夫碱、戊二酮和偶氮化合物作为配体时，通常可发生取代反应并生成新的金属配合物。例如： 3 固相反应合成法 广义地讲，凡是有固相参与的化学反应都可称为固相反应。例如，固体的热分解、氧化，以及固体与固体、固体与液体之间的化学反应等都在固相反应范畴。但从狭义上，固相反应常指固体与固体间发生化学反应生成新的固体产物的过程。金属配合物的固相合成法主要指利用固体配体和相应的金属化合物反应得到配合物，或者用已知的固态配合物制备配合物的新物种。 固体配体和金属化合物的固相反应通常使用的配体的熔点较低，在反应条件下配体呈熔融液态，配体与金属化合物的固相反应实际上是熔融配体与固态金属化合物之间的复相反应。该方法操作十分简单，适用于制备Co、Cu、Ni、Pd、Pt等过渡金属离子与膦、胂、锑及其衍生物形成的配合物，例如，将三苯基膦与二氧化钯加热，即可制得黄色的Pd配合物，而过量的配体可借萃取除去：PdCl2s+2PC6H53lPd［PC6H53］2Cl2用已知的固态配合物制备新的配合物主要有热解法制备新的配合物和通过生成M—M键制备新的配合物两种方法。 1 热解法制备新的配合物。利用许多配合物在受热时会逐步放出电中性的挥发性配体的方式，或者在某一温度范围内配合物内界配体可被外界阴离子取代的方式，生成新的配合物。例如： 2 生成M—M键制备新的配合物。该合成方法典型的例子是将K2［NiCN4］在氦气气氛中加热，然后用N，N 二甲基甲酰胺DMF萃取产物，可得到含Ni—Ni的配合物K4［Ni2CN6］。该反应式如下： 4氧化还原反应合成法 许多金属配合物的制备常利用氧化还原反应合成法。将含有不同氧化态的金属化合物，在配体的存在下使其适当地氧化或还原以制得该金属 ……

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