1
DNA测序简介
Stuart M. Brown
DNA测序简史
人类基因组计划（Human Genome Project，HGP，1995~2003）中所有DNA测序工作都是通过Frederick Sanger在1975年发明的测序法加以改进而完成的（Sanger and Coulson 1975）。在Sanger的工作之前，部分核苷酸序列通过RNA合成和酶消化的点对点（ad hoc）方法测定。1971年康奈尔大学的Ray Wu发表过类似Sanger法的测序法（Wu and Taylor 1971），他通过DNA聚合酶向单链末端增加带有放射性标记的互补核苷酸，用酶切反应和色谱法等一系列方法，成功测定了噬菌体λDNA单链末端的12个碱基。1973年，Walter Gilbert 和Allan Maxam发表了大肠杆菌（Escherichia coli）基因组中乳糖操纵子（转录阻遏物结合位点）的24个碱基序列（Gilbert and Maxam 1973）。他们使用了一系列复杂的混合方法，包括部分酶切消化的嘧啶指纹、色谱法和体外转录RNA分子的酶切反应等。比利时根特大学的Walter Fiers和同事测定了噬菌体MS2外壳蛋白的所有序列（Min Jou et al. 1972）。该方法基于噬菌体RNA的核酸酶消化作用，部分依赖于通过RNA聚合酶和不完整核苷酸混合物在体外合成RNA，并对RNA片段进行化学测定。Fiers使用已知蛋白质序列信息来限制可能的密码子，并且组装重叠片段。
Sanger在1975年发明的测序法通过DNA聚合酶使人工合成的短寡聚核苷酸引物延伸，与单链DNA模板杂交，合成新的DNA片段。Sanger测序法的第一个版本使用双阶段DNA合成反应。在第一阶段，测序引物利用4种三磷酸脱氧核苷酸（dATP、dCTP、dGTP和dTTP）的混合物进行部分延伸，生成一批新合成的DNA片段，它们全部以引物为起始，延伸至“随机”长度。在第二阶段，部分延伸的模板被分成4个平行的DNA合成反应，每个反应只包括4种三磷酸脱氧核苷酸中的3种。“合成并尽可能在每条链上持续延伸：因此，如果dATP是未加入的那个三磷酸盐，每条链都会在3′端终止于A残基前的位置”（Sanger and Coulson 1975）。接着，新合成的DNA片段从模板链变性分离，通过丙烯酰胺凝胶电泳在相
購物車/收銀台(
0
) | 在線留言板
| 付款方式
| 聯絡我們
| 運費計算
| 幫助中心 |
加入書簽
HOME
新書上架
